운동은 미토콘드리아의 생합성(biogenesis)을 증가시키는 주요 원인으로 제시되고 있으며, 이는 제2형 당뇨병(type II diabetes) 등 기타 대사 질환을 예방·치료하는 효과가 있다고 알려져 있다. 따라서 최근 운동 생리학 분야에서는 운동에 의한 미토콘드리아 생합성이 증가되는 현상을 과학적으로 규명하기 위한 시도가 계속되고 있다[1]. 일회성(acute or single bout) 운동이나 일상적(regular) 혹은 장기간(chronic)의 반복된 훈련(endurance training)은 골격근 내 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 수많은 유전자(gene) 및 단백질의 증가를 수반한다[2].

운동은 미토콘드리아 생합성 증가를 조절하는 것으로 알려진 PPAR-γ co activator 1α (PGC-1α), mitochondria transcription factor A (Tfam) 그리고 Acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 같은 핵 내 유전자를 발현시킬 뿐만 아니라, AMP kinase (AMPK)와 Sirtuin 같은 생리활성화 효소의 활성을 증가시켜, 미토콘드리아의 수와 크기를 증가시킨다[3]. 최근 Nitiric oxide (NO)가 미토콘드리아 생합성에 중요한 역할을 하고 있음이 보고되고 있는데, NO는 지방세포에서 미토콘드리아 생합성 관련 유전자의 증가에 기여할 뿐만 아니라, 골격근에서의 NO 생성이 glucose uptake와 미토콘드리아 생합성에 중요한 신호 전달 체계로서 제기되고 있다[4]. Cyclic guanosine monophosphate (cGMP)의 활성화는 NO 발생을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, cGMP의 활성은 calcium binding protein과 calcineulin과 같은 calcium signal factor와 함께 미토콘드리아 생합성과 관련된 AMPK 신호기전을 조절하는 것으로 알려져 있다[5,6]. 그뿐만 아니라, 근수축으로 인한 endotherial nitric oxide synthase (eNOS)의 활성화는 미토콘드리아 생합성을 조절하는 중요 조절자로 보고되고 있다[7]. 그러나 현재까지의 연구는 근수축에 의한 NO의 발생이 미토콘드리아의 생합성에 중요한 변인임만을 증명하고 있으며, cGMP나 Ca²⁺ 관련 신호단백질과의 관련성에 대한 연구가 부족하여 운동을 통한 미토콘드리아 생합성의 정확한 신호전달체계에 대한 해석이 불명확한 실정이다.

골격근에 분포하고 있는 것으로 알려진 NOS는 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) 그리고 iducible NOS (iNOS)가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내 L-arginine을 산소와 결합시킴으로써 산출물인 NO와 L-citruline을 생성하는 효소이다[4,8]. 또한 미토콘드리아에도 NOS가 존재(mtNOS)하며, 주로 eNOS가 골격근의 미토콘드리아에서 관찰된다[9]. NOS를 활성화시키는 세포 내 신호전달 체계는 다양하게 보고되고 있는데, Ca²⁺/Calmodulin complex, caveolin-1/3, HSP90 등과 같은 신호 단백질과 결합하거나, 세포 내 reactive oxygen species (ROS) 중의 하나인 H₂O₂와 같은 활성산소에 의해 NOS의 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다[10,11]. 다양한 NOS 활성화 체계가 보고되고 있음에도 불구하고 운동에 의해 NOS가 발생되는 기전에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않고 있는데, 최근 보고된 바에 의하면, eNOS가 knock out (KO)된 mice의 지방세포에서 지구성 훈련으로 인한 지방세포의 갈색화(browning) 효과가 나타나지 않음을 보고하고 있으며, 미토콘드리아 생합성 지표들도 유의하게 증가하지 않았음을 보고한 바 있다[12]. 이러한 결과는 지구성 훈련에 의한 NOS 활성화가 미토콘드리아 생합성을 조절할 수 있음을 제시하는 중요한 결과이다. 또한 S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)과 같은 NO donor를 세포에 처리한 실험에서 미토콘드리아 생합성이 증가되며, mitochondrial DNA (mtDNA) 양의 증가와 함께 산화적인 인산화를 통한 ATP 생성이 활성화된다고 하였는데, 이러한 결과는 운동에 의한 NO의 증가가 미토콘드리아 생합성에 중요한 변인이 될 수 있음을 제시하고 있다[13,14].

골격근 수축 시 증가하는 세포 내 Ca²⁺은 Gene transcription과 세포 내 신호체계를 조절하는 중요 인자로 알려져 있으며, calcineurin, Ca²⁺/Calmodulin dependent protein kinase II (CaMKII) 그리고 Ca²⁺ dependent protein kinase C (PKC)와 같은 인자의 활성화는 미토콘드리아 생합성 및 산화적 인산화 능력의 향상을 가져온다[15-17]. 특히 CaMKII의 인산화는 운동을 통한 미토콘드리아 생합성 증가의 핵심적인 인자인 PGC-1α의 핵 내 이동을 증가시키며[18], PGC-1α는 미토콘드리아 생합성과 지방산 산화반응을 촉진하며, 골격근/심장근의 성장과 백색지방의 browning 반응을 조절하는 핵심인자로 알려져 있다[19]. 심장근에서의 β-adrenalergic 자극은 세포 내 Ca²⁺을 증가시켜, CaMKII의 활성을 증가시키는 것으로 보고되고 있는데, 이러한 신호과정은 이차적으로 NOS를 활성화하여, NO를 증가시키며, 근형질세망(sarcoplasmic reticulum, SR)에서의 Ca²⁺ 방출을 조절한다고 알려져 있다[20].

현재까지의 연구결과들은 NOS의 활성화 기전에 대해 세포 내 Ca²⁺ 신호전달 체계에 대한 고찰이 부족한 것이 사실이며, 특히 CaMKII와 같은 calcium binding protein에 의한 활성화 기전에 대한 연구결과가 부족한 실정이다. 또한 현재까지의 연구결과들은 몇몇 in vivo 실험을 통해 지구성 운동 시 NO 발생 억제를 통한 미토콘드리아 생합성 억제 효과만을 규명하였다. 따라서 본 연구자는 골격근 수축을 통해 증가하는 NO가 Ca²⁺ 신호체계에 의존적인지, Ca²⁺ binding protein에 의한 이차적 기전에 의해 조절되는지를 밝히기 위해, Ca²⁺ 신호체계 억제제와 Ca²⁺ binding protein kinase 억제제를 이용하여, 골격근 수축이 어떻게 NO 생성에 기여하는지를 규명하고자 하였으며, 골격근 수축에 의해 발현된 조절단백질에 의해 미토콘드리아 생합성과 관련된 여러 단백질과 mRNA의 증가가 어떠한 관계가 있는지를 규명하고자 하였다.

운동은 골격근 수축을 지속하기 위한 대사체계를 활성화시키며, 이는 다양한 세포 내 신호체계를 활성화시킨다. 반복적인 운동은 골격근 세포 내의 단백질 동화작용을 촉진시키며, 미토콘드리아 크기와 수의 증가로 대표되는 미토콘드리아 생합성 증가의 원인이 된다[24,25]. 본 연구에서는 미토콘드리아 생합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NOS의 활성화 과정에서 CaMKII의 활성화가 중요한 역할을 하고 있음을 관찰하였으며, 특히 CaMKII로 인한 nNOS의 인산화가 골격근 수축을 통한 NO 생성 과정을 조절하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과와 함께, CaMKII에 의한 NO 생성은 미토콘드리아 생합성 증가지표인 PGC-1α의 deacetylation을 조절함을 확인하였으며, 결국 in vivo 및 in vitro 실험을 통해 세포와 조직수준에서의 미토콘드리아 생합성 관련 지표의 조절기능을 하고 있음을 밝히고 있다.

골격근에는 3가지 종류의 NOS가 혼재되어 있음이 보고되고 있다. Neuronal NOS (nNOS, NOS1), endothelial NOS (eNOS, NOS3) 그리고 inducible NOS (iNOS, NOS2)가 있으며, 골격근 조직에 nNOS/eNOS가 일반적으로 발현되어 있는데 반해, iNOS는 type 2 diabetes이나 대사이상 등의 염증반응에 의해 특이적으로 증가하는 것으로 알려져 있다[26,27]. 본 연구에서는 골격근에서 NO 생성 기전을 확인하기 위하여 in vitro적으로 골격근에서 single fiber를 분리하여 근수축을 통한 신호기전과 in vivo에서 운동 모델을 이용하였다. 특히 nNOS와 eNOS를 세포수준과 조직수준에서 비교한 결과(Fig. 1A), primary cell에서는 nNOS가 주로 발현되어 있음을 확인하였으며, 전기자극을 통한 근세포 수축 시 NO 발생기전이 nNOS에 의해 주로 조절됨을 nNOS의 억제제 및 단백질 knock down 실험을 통해 알 수 있었다(Fig. 1C-F). 골격근 세포에서 nNOS는 plasma membrane을 이루고 있는 dystrophin associated glycoprotein complex를 이루고 있는 α-syntrophin과 결합되어 있다고 알려져 있다[28]. 근절 부분의 nNOS는 특히 type II 근세사에서 많이 나타나는 것으로 알려져 있으며, 운동 시 혈관 상피세포(endothelial cell)의 eNOS와 함께 NO 생성을 동반 상승시키는 효과를 가져옴으로써 혈류 증가와 골격근 수축을 위한 대사활성화에 기여한다[29]. 본 연구에서는 골격근 세포를 분리하여 실험을 실시한 결과, nNOS가 골격근 세포수준에서 주로 발현되어 있으며, 조직수준에서는 nNOS/eNOS가 동시에 발현되어 있음을 확인하였는데, 이는 조직수준의 경우 혈관내피세포를 포함하고 있기 때문으로 생각된다. 그러나 Tengen et al. [30]에 의하면 골격근 세포의 미토콘드리아와 eNOS가 co-expression되어 있음을 제시하고 있으며, Bates et al. [31]에 의하면 미토콘드리아 eNOS를 mtNOS라고 명명하며, eNOS와 많은 homology를 가지고 있다고 하였다. 본 연구에서 eNOS는 Fig. 1E에서와 같이 근세포에서 eNOS를 knock down 실험을 실시한 결과, 골격근 수축으로 인한 NO 생성과 미토콘드리아 생합성 지표의 유의한 감소를 나타내지 않았는데, 차후 mtNOS를 knock down 실험을 통해 골격근 수축에 의한 eNOS homology가 높은 NOS의 기능에 대해 연구할 필요가 있다고 생각된다. 그러나 실제 in vivo 연구에서는 nNOS와 eNOS의 knock down 모두에서 유의한 NO 생성 감소와 미토콘드리아 생합성 지표의 감소를 보였다(Fig. 3). 조직수준에서 NO의 생성은 상피세포, 면역세포, 신경세포 그리고 조혈모세포 등의 복합적인 영향에 의해 조절되며[32], 운동으로 수반되는 혈관확장 등의 다양한 영향을 받는다[33]. In vivo 실험에서 NO 억제제인 L-NAME을 처치하면, 운동으로 인한 혈관확장과 미토콘드리아 생합성이 감소하게 되는데, 이는 운동에 의한 조직수준의 NO 생성이 중요한 요인임을 제시하고 있다[34,35]. 이러한 결과는 운동으로 인한 미토콘드리아 생합성 조절기전에 있어 NO 생성이 중요한 역할을 하고 있음을 제시하고 있지만, 운동 시 조직수준에서의 NO 생성은 보다 복잡한 신호기전을 통해 조절될 수 있음을 제시하고 있다. 따라서 본 연구에서 실시한 electroporation 방법을 이용한 실험은 조직수준의 nNOS/eNOS를 모두 감소시켰을 것임으로 골격근 세포 수준에서 knock down 효과에 의해 조절되었기보다는 골격근 조직 내의 다양한 세포에서 발현 감소로 인한 결과가 나타난 것으로 생각된다.

NOS 자체 효소활성을 조절하는 기전에 있어 중요한 신호전달 물질은 cyclic GMP (cGMP)로 알려져 있으며, 세포 내 cGMP의 수준은 세포 내 Ca²⁺ 신호기전 및 다양한 부속단백질에 의해 조절됨이 제시되고 있다[36]. CaMKII는 Ca²⁺ 의존성 protein kinase의 하나로 다양한 세포 내 단백질을 인산화하는 중요단백질이며, 세포 내 Ca²⁺ 신호의 크기와 빈도에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다[37]. CaMKII는 미토콘드리아 생합성을 조절하는 중요인자이며, 골격근 수축, high fat diet 등에 의한 세포 신호 전달에 의해 autophosphorylation되어 활성화되어 Tfam, PGC-1α과 같은 미토콘드리아 생합성 관련 gene transcription을 조절하는 중요 변인이 된다[38].

본 연구에서는 세포수준에서 근수축과 함께 CaMKII의 인산화가 증가하였으며(Fig. 2A), CaMKII 억제제인 AIP를 사용한 결과, NO 생성이 억제되는 반면, NO 억제제는 근수축으로 인한 CaMKII의 인산화를 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 CaMKII가 NOS의 조절자가 될 수 있는 결과를 제시하고 있다. 이러한 현상과 관련된 많은 연구결과는 보고된 바 없으나, 신경세포의 허혈 상태(ischemia)에서 CaMKII는 nNOS의 serine (s847) residue 인산화를 조절하는 중요 조절자로 알려져 있다[39]. 또한 뇌하수체(pituitary) 암세포(cancer)의 경우, CaMKII를 억제하게 되면, nNOS의 Ser1412의 인산화가 억제되어 NO 생성이 감소함도 보고되고 있다[40]. 이러한 결과는 운동에 의한 CaMKII활성의 증가가 nNOS의 인산화를 조절함으로써 NO 생성을 조절할 수 있음을 제시하고 있다. 본 연구에서도 근수축 시 nNOS의 Serine residue 인산화가 CaMKII 억제제에 의해 조절됨을 확인하였으며(Fig. 2D), 이러한 NOS 인산화의 억제는 미토콘드리아 생합성 지표의 감소를 가져왔다. 따라서 운동으로 인한 CaMKII의 인산화는 골격근 내 NO를 조절하는 중요기전임을 확인하였으며, 미토콘드리아 생합성 조절에 중요한 기전임을 알 수 있었다[18].

그러나 골격근 수축 시 증가하는 세포 내 Ca²⁺은 CaMKII 이외에도 calcineulin, protein kinase C (PKC) 등의 다양한 Ca²⁺ dependent enzyme의 활성을 증가시키는 요인이며, 이들 인자도 골격근의 수축 및 운동에 증가하여 미토콘드리아 생합성을 조절하는 중요인자가 될 수 있다[41,42]. 본 연구에서는 CaMKII의 억제가 골격근 수축에 따른 NOS의 인산화와 미토콘드리아 생합성 지표의 변화를 확인하였을 뿐, 운동에 의해 증가되는 단백질의 발현 경향에 대해서는 확인하지 못하였으므로 차후 연구를 통해 다른 Ca²⁺ dependent protein kinase와의 연관성도 추가로 규명되어야 할 것으로 생각된다.

당뇨, 고혈압 등의 대사질환을 완화하는 운동의 효과를 운동생리학적으로 규명하는 데 있어 많은 연구들이 진행 중이다. 본 연구에서는 미토콘드리아 생합성 지표를 조절하는 것으로 알려진 NO의 생성 기전에 대해 규명하려고 하였으며, CamKII가 중요한 역할을 하고 있음을 제시하고 있다. 이러한 결과는 운동으로 인한 미토콘드리아 생합성 증가의 조절기전을 규명하는 데 과학적 근거를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

세포수준과 조직수준에서 nNOS/eNOS의 발현을 비교한 결과, 세포수준에서는 nNOS가 주로 발현되어 있는 것을 확인하였다. 골격근 수축 시 nNOS 억제제 및 nNOS 단백질 knock down은 골격근 수축으로 인한 NO 생성 및 미토콘드리아 생합성을 유의하게 억제한 반면, eNOS 억제제 및 eNOS 단백질 knock down은 억제하지 못하였다. 반면 조직수준에서 nNOS/eNOS 단백질을 knock down한 결과 운동으로 인한 NO생성 및 미토콘드리아 생합성 지표의 유의한 감소를 가져왔다. 골격근 수축으로 인한 NO의 생성기전에서 CaMKII의 억제는 nNOS의 인산화와 미토콘드리아 생합성 지표를 감소시키는 중요원인이 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 세포수준에서 골격근 수축에 의한 CaMKII의 활성 증가가 NOS를 통한 NO 생성을 조절하는 중요기전임을 제시하고 있으며, 조직수준에서 NO 생성 및 미토콘드리아 생합성 증가 기전은 보다 복잡한 기전에 의해 조절되고 있음을 제시하고 있다.